גרם כתם יסוד, חומרים, טכניקה ושימושים

ה כתם גראם היא טכניקת הכתם הפשוטה והשימושית ביותר במיקרוביולוגיה של האבחון. טכניקה זו נוצרה על ידי הרופא הדני הנס כריסטיאן גראם בשנת 1884, שהצליח לסווג את החיידקים בגראם חיוביות וגראם שלילי, על פי הרכב קיר התא.

הטכניקה עברה שינויים מסוימים על ידי האקר בשנת 1921 כדי לייצב את ריאגנטים ולשפר את איכות הכתם, כך הכתם גרם ידוע גם בשם Gram-Hucker.

בעזרת טכניקה זו ניתן גם לראות את צורת המיקרואורגניזמים, כלומר, אם הם cocci, bacilli, coccobacilli, pleomorphic, filamentous, בין היתר. כמו גם את החלוקה בחלל: באשכול, בשרשרת, מבודדים, בזוגות, בטטרדים וכו '..

כאשר זיהום חיידקי חשוד, רוב הדגימות שהתקבלו יש להפיץ על שקופית ומוכתמת גרם לבדיקה תחת המיקרוסקופ..

הדו"ח של הגראם ינחה את הרופא על איזה סוג של מיקרואורגניזם יכול להיות הגורם לזיהום, לפני קבלת התוצאה הסופית של היבול.

במקרים מסוימים חייו של המטופל נפגעים מאוד, ולכן הרופאים זקוקים בדחיפות לדוח הגראם כדי להציב טיפול אמפירי, תוך המתנה לזיהוי המיקרואורגניזם.

לדוגמא, אם גרמתי מגלה שיש Cocci החיובי גראם ב- CSF, הרופא להנחות את הטיפול האנטיביוטי הראשוני לחסל סוגים אלה של חיידקים, על פי פרוטוקולים הוקמו לכך.

לאחר שהתוצאה הסופית מגיעה עם השם של המיקרואורגניזם המבודד והאנטיביוגרפיה שלו, הרופא יעריך אם לשנות את הטיפול. החלטה זו תיעשה על פי המחקר של רגישות של מיקרואורגניזם לאנטיביוטיקה שהוא מקבל ואת האבולוציה של המטופל.

אינדקס

• 1 קרן
• חומרים
• הכנת צבעים וריאגנטים
  • 3.1 פתרון קריסטל ויולט
  • 3.2 Iodo-Lugol
  • 3.3 הלבנה
  • 3.4 ניגודיות
• 4 אחסון של ריאגנטים
• 5 הכנת התפשטות המדגם לצביעה
  • 5.1 - גרף של דוגמאות ישירות
  • 5.2 - גרגר של יבולים
• 6 טכניקה
• 7 השירות
• 8 טעויות נפוצות
• 9 הפניות

קרן

זוהי טכניקה המציגה 4 שלבים בסיסיים: מכתים, קיבוע עם mordant, דהוי contratinction. לכן, טכניקה זו בנוסף צביעה החיידקים, גם מבדיל אותם.

סגול הקריסטל הוא צבעוני הראשון בשימוש. יש לו זיקת פפטידוגליקן ואת הכתם סגול כל החיידקים אז Lugol, מתנהג כמו עוקצני, כי מושם, יניע את ההיווצרות של קומפלקסים מסיסים של יוד הסגולה קריסטל - חלבוני ribonuclear בתוך התא.

חיידקים חיוביים גראם, שיש קיר עבה של peptidoglycan, טופס מורכבות יותר (קריסטל ויולט יוד), ולכן הם שומרים על צבע.

זה גם משפיע כי החיידק חיובי חיידקים הקיר מכיל כמות גדולה יותר של חומצות בלתי רוויות, אשר מראים זיקה גבוהה עבור חומרים חמצון (Lugol).

בינתיים, חיידקים גראם שליליים יש שכבה דקה של peptidoglycan, מה שהופך את החיידקים מורכבים פחות חיידקים חיוביות גרם.

ואז מגיע שלב של שינוי צבע, שבו גראם חיובי וחיידקים שליליים גראם מתנהגים אחרת.

חיידקים שליליים גראם מכילים קרום חיצוני עשיר lipopolysaccharides כי הוא חלק מקיר התא שלה. שומנים נהרסים על ידי מגע עם אצטון אלכוהול, כך הקרום החיצוני הוא לערער, ​​גביש סגול משתחררים.

כך זה counterstained אז עם safranin או fuchsin בסיסי, לוקח את הצבע האדום.

במקרה של חיידקים חיוביים ל- Gram, הם מתנגדים לזיהוי כיוון שהאקונומיקה פועלת לסגירת הנקבוביות, דבר המונע את תסביך הקריסטל ויוד / יוד מלהימלט.

לכן, צבע עם קריסטל ויולט הוא יציב, ואין מקום safranin או fuchsin. בגלל זה, אלה חיידקים כתם כחול עז או סגול.

חומרים

ערכת הצבעים של הגראם מורכבת מ:

• קריסטל ויולט
• לוגול
• אלכוהול אצטון
• ספראין או פוקסין בסיסי

הכנת צבעים וריאגנטים

קריסטל ויולט פתרון

פתרון א:

ויולט קריסטל -2 גרם

אלכוהול אתילי 95% -20cc

פתרון ב '

אמוניום אוקסלט -0.8 גרם

מים מזוקקים - 80 סמ"ק

עבור ההכנה הסופית של קריסטל ויולט, הפתרון 1:10 צריך להיות מדולל עם מים מזוקקים מעורבב עם 4 חלקים של פתרון B. התערובת מאוחסן במשך 24 שעות לפני השימוש. זה מסונן בבקבוק עבור מכתים ענבר באמצעות מסנן נייר.

הסכום שישמש היומי מועבר בקבוק ענבר עם טפטפת.

יודו-לוגול

לשקול ולמדוד את הסכום המצוין של כל מתחם, כדלקמן:

קריסטלים של יודו -

אשלגן יודיד - 2 גרם

מים מזוקקים - 300 סמ"ק

אשלגן יודיד מתמוסס מעט על ידי מעט מים ואז יוד נוסף. הפתרון הוא מגולח בקבוק בצבע ענבר.

הסכום שישמש היומי מועבר בקבוק ענבר קטן עם טפטפת.

הלבנה

95% אלכוהול אתילי 50 מ"ל

אצטון - 50 מ"ל

הוא מוכן בחלקים שווים. מכסים היטב, הוא נוטה להתאדות.

מניחים בבקבוק עם טפטפת.

הכנה זו מספקת שינוי צבע בזמן בינוני 5-10 שניות והוא מומלץ ביותר.

מתחילים מעדיפים להשתמש רק באלכוהול 95% אתילי, שבו שינוי צבע הוא איטי יותר מ 10 עד 30 שניות.

בעוד המנוסה ביותר יכול להשתמש אצטון טהור, שבו שינוי צבע מתרחשת מהר מאוד 1 עד 5 שניות.

ניגודיות

פתרון המניות של ספרן

ספרנינה -2.5 גר '

אלכוהול אתילי 95% -100 סמ"ק

לאחר שקילה את הסכום המצוין של safranin מומס 100 סמ"ק של אלכוהול אתילי ל 95%.

הפתרון safranin עובד מוכן לפתרון המניות.

כדי לעשות זאת, למדוד 10 סמ"ק של פתרון המניות, להוסיף 90 סמ"ק מים מזוקקים כדי להשלים 100 מ"ל.

מומלץ להעביר את הסכום שישמש מדי יום לבקבוק ענבר עם טפטפת.

מיקרואורגניזמים כי כתם חלש גראם שלילי עם כתם גראם האקר, כגון anaerobes מסוימים, Legionella sp, Campylobacter sp ו Brucella sp, הם יכולים להיות מוכתמים הרבה יותר אם השינוי שנעשה על ידי קופלוף מכתים גראם האקר, הנקרא גראם-קופלוף הכתם, משמש.

טכניקה זו משנה את צבע safranin ידי fuchsin בסיסי. עם שינוי זה ניתן למעשה לצבוע את המיקרואורגניזמים הנ"ל.

אחסון ריאגנטים

צבעים מוכנים יש לאחסן בטמפרטורת החדר.

הכנת מדגם להפיץ צבע

מדגם חייב להכיל לפחות 10⁵ מיקרואורגניזמים לפני תצפית של מיקרואורגניזם במריחה סביר. ממרחים ניתן לבצע מדגם ישיר או תרבויות מדיה מוצק או נוזלי.

ממרחים צריך להיות אחיד, מופץ היטב ולא עבה מדי, עבור ויזואליזציה טובה יותר של המבנים הנוכחיים.

-גרם של דוגמאות ישירות

השתן גרם ללא צנטריפוגה

שתן הוא מעורב 10 μl ממוקם על שקופית. התצפית של לפחות אחד חיידקים / טבילה שדה מציין כי יש זיהום.

משמעות הדבר היא כי התרבות תהיה יותר מ 100,000 CFU / ml (10⁵ CFU / mL) של שתן ב 85% מהמקרים.

שיטה זו אינה שימושית עבור ספירת מושבה מתחת 100,000 CFU.

LCR גרם

CSF צריך להיות centrifuged, supernatant הוסר ואת גלולה התפשט על שקופית. נוזל זה הוא סטרילי בתנאים רגילים; תצפית של חיידקים מציין זיהום.

גרם של דגימות נשימה

כיח, ברונכיום או שטיפה ברונכואלוואלית, אם כי ייתכן שיש מגוון של מיקרואורגניזמים, תמיד ידריך באבחון, מלבד היותו שימושי סוג של תאים שנצפו.

במקרה של כיח, את המריחה צריך להיות מוכן עם חלקים ססגוני ביותר של המדגם.

שרפרף צואה

לא מומלץ לבצע את הגראם לסוג זה של דגימות, כיוון שאין לו ערך אבחוני.

-גידולי גראם

הם יכולים להיעשות בשתי דרכים, אחד מן היבולים נוזלי ועוד מן הגידולים מוצק.

גידולים נוזליים

מ תרבויות נוזלי זה פשוט מאוד; תחת מצית כמה קלויים של מרק עכור נלקחים והם ממוקמים על שקופית נקייה ויבשה, נותן תנועות מעגליות מהמרכז אל הפריפריה, כדי להפיץ את החומר באופן אחיד.

מותר להתייבש באופן ספונטני באוויר. לאחר הייבוש, החומר קבוע לסדין בחום. לשם כך, בעזרת מהדק, הסדין 3 מועבר 4 פעמים דרך הלהבה של מבער Bunsen, נזהר לא לשרוף את החומר.

הסדין מותר להתקרר והניח על גשר צביעה.

גידולים מוצקים

כדי לבצע תוסף עבור כתם גרם מתרבות מוצקה, בצע את הפעולות הבאות:

לפני בחירת המושבות להילקח, השקופית צריכה להיות מוכנה, הצבת שתי טיפות בערך של תמיסת מלח פיזיולוגית סטרילית.

אם צלחת התרבות המקורית מכילה כמה סוגים שונים של מושבות, מושבה מבודדת של כל אחד מהם ייבחר לבצע את הגראם. המושבה כל יילקחו עם לולאה פלטינה כדי לפזר אותו תמיסת מלח בעבר להציב את השקופית.

תנועות מעגליות ניתנות מהמרכז לפריפריה, להפיץ את המושבה באופן הומוגני בשקופית..

מותר להתייבש באופן ספונטני באוויר. לאחר יבש את הסדין הוא קבוע עם חום, כפי שהוסבר לעיל (להבהב את השקופית עם המצית), נזהר לא לשרוף את החומר.

הליך זה חייב להתבצע עם כל סוג אחר של מושבה. על פיסת נייר יש לציין את סדר המצוי, למשל:

מושבה 1: מושבת הבטא-המוליטית היוונית: Cocci חיובי גראם נצפו באשכולות

מושבה 2: מושבת קרם, ללא המוליזה: Coccobacilli שלילי היו נצפו.

כל גיליון חייב להיות מתויג כדי לדעת מה אנחנו מתבוננים.

טכניקה

טכניקת גראם מכתים היא פשוטה מאוד לביצוע זול יחסית ולא ניתן לפספס במעבדה מיקרוביולוגיה.

כך גם:

1. לתקן את כתם עם החום במקום על הגשר הצבעוני.
2. הסדין מכוסה לחלוטין עם זכוכית סגולה למשך 1 דקה.
3. לשטוף עם מים. אין להתייבש
4. מכסים את הצלחת עם פתרון Lugol, לעזוב למשך 1 דקה. לשטוף עם מים. אין להתייבש.
5. תערובת במשך 5-10 שניות עם תסיסה עדינה באצטטון אלכוהול. או להניח את הסדין במצב זקוף ושחרר טיפות של סוכן decolorizing על פני השטח עד זכוכית סגולה הנותרים נגרר משם. אין לחרוג.
6. לשטוף עם מים. אין להתייבש.
7. החלף את הסדין על הגשר הצבעוני לכסות 30 שניות עם Safranin (גרם האקר) או 1 דקות עם fuchsin בסיסי (Gram-Kopeloff).
8. לשטוף עם מים
9. אפשר לייבש באופן ספונטני באוויר אנכי.

לאחר הייבוש, במקום 1 טיפה של שמן טבילה כדי לצפות בו תחת המטרה של 100X במיקרוסקופ אופטי.

השירות

טכניקה זו מאפשרת להבחין בין הבדלים morphotypeintial של רוב החיידקים.

שמרים נבדלים גם על ידי צבע זה. הם לוקחים את קריסטל ויולט, כלומר, הם כתם גראם חיובי.

מצד שני, גראם חיובי borilli להרכיב נבדל, שבו חלל ברור שנצפה בתוך bacillus, שם endospore נוצר, למרות נבגים לא כתם טוב. כדי להשתמש נבגים, טכניקות אחרות כגון שייפר- Fulton משמשים.

יש לציין כי כתם זה אינו משמש צבע כל סוגי החיידקים, כלומר, ישנם מקרים בהם מכתים לא עובד.

במקרה זה, ניתן להזכיר חיידקים שאין להם קיר תא. לדוגמה: מין Mycoplasma, spheroplasts, Ureaplasma, L- צורות ו protoplasts.

זה גם כתמים קשות חיידקים עם קירות עשירים חומצות mycolic, כגון Mycobacteria וחיידקים תאיים כגון Chlamydias ו Ricettsias.

זה גם לא יעיל כתם חיידקים spirochetal ביותר.

ישנם חיידקים מאותו הסוג שניתן להבחין בהם במדגם זהה ל- Gram חיובי ולגרם שלילי. כאשר זה קורה זה נקרא כתם גרם משתנה, אשר עשוי להיות עקב שינוי בחומרים מזינים, טמפרטורה, pH או ריכוז אלקטרוליטים..

טעויות נפוצות

Bleach מוגזם

מגזים ב צעד דהוי יכול לגרום תצפית של מיקרואורגניזמים שלילי גראם שלילי.

אל תחכו מספיק זמן ייבוש להוסיף שמן טבילהYou

שגיאה זו גורמת להיווצרות של micelles שומן המקשים על המבנים הנוכחיים. זה קורה כאשר השמן מצטרף למולקולות המים הנמצאות במריחה.

הפוך את הסדר של ריאגנטיםYou

שגיאה כזו תגרום לחיידקים שליליים של גראם להציג סגול, כלומר, חיובי גראם חיובי.

השתמש בגידולים ישנים (מוצקים או נוזליים):

זה יכול לגרום חיידקים חיוביים גרם כתם גראם שלילי (גראם כוזב שלילי). זה קורה כי בתרבויות הישנות סביר כי יש חיידקים מתים או מתדרדר ובתנאים אלה החיידקים לא שומרים על קריסטל סגול.

השתמש פתרון ישן מאוד Lugol:

במשך הזמן lolol מאבד את תכונותיו ואת צבע fades. אם מגיב מנוון כבר בשימוש, זה לא יתקן את סגול קריסטל, ולכן יש את האפשרות לקבל הדמיה של מיקרואורגניזמים שווא Gram שלילי.

רקע כחלחל

רקע דהוי כהלכה יהיה אדום. רקע כחול מציין כי צבע לא היה מספיק.

הפניות

1. ראיין ק. ג., ריי ג. שריס. מיקרוביולוגיה מהדורה רפואית, מהדורה 6, מקגרו-היל, ניו-יורק, ארה"ב
2. Koneman E, אלן S, Janda W, Schreckenberger P, Win W. (2004). אבחון מיקרוביולוגי. (מהד 'ה -5). ארגנטינה, עריכה Panamericana S.A..
3. פורבס B, סחם D, Weissfeld A. 2009. אבחון מיקרוביולוגי של ביילי & סקוט. 12 ed. ארגנטינה Panamericana S.A העריכה
4. Casas-Rincón G. 1994. כללי Mycology. מהדורה שנייה, אוניברסיטת Universidad de ונצואלה, מהדורות ספריה. ונצואלה, קראקס.
5. "כתם גרם" ויקיפדיה, האנציקלופדיה החופשית. 4 אוקטובר 2018, 23:40 UTC. 9 דצמבר 2018, 17:11. נלקח מ es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011 מדריך של מיקרוביולוגיה רפואית. מהדורה שנייה, ונצואלה: הנהלת התקשורת ופרסומיה של אוניברסיטת קראבובו.
7. לופז-Jácome L, הרננדז-Durán M, C קולין-קסטרו, Pena-אורטגה S, G Cerón-גונזלס, פ פרנקו-Cendejas צבעי יסוד במעבדה למיקרוביולוגיה. מחקר על מוגבלות. 2014; 3 (1): 10-18.