רצף דנא Maxam-Gilbert, שיטת סאנגר, דוגמאות

ה רצף DNA (חומצה deoxyribonucleic) הוא הליך בביצוע מעבדות ביולוגיה מולקולרית המאפשרת לדעת את הסדר של נוקליאוטידים בחומר הגנטי של עניין. בנוסף, רצף של RNA (חומצה ribonucleic) יכול גם להתגלות.

טכניקה זו הייתה הכרחית לפיתוח של מדעי הביולוגיה. הוא חל גם על תחומים אחרים של ידע - כגון אבחון רפואי וחקירות פליליות, למשל.

בעבר, רצף של גדילה של דנ"א נחשב פעילות איטית ויקר, אשר אפשרה זיהוי של זוגות זוג בודדים רק את oligonucleotides.

היום, עם כל ההתקדמות של המדע, רצפי DNA היא פעילות שגרתית מעבדות רבות בזכות ברחבי העולם כדי התרומה של כמעט 50 שנים של מחקר בתחום זה. באשר אורך הרשת, אתה יכול רצף עד מיליוני זוגות הבסיס בזמן קצר מאוד.

לשם כך, יש עשרות טכניקות שפותחו משתנות מחיר ודיוק. במאמר זה נתאר גם טכניקות קלאסיות ומודרניות, כל אחת עם היתרונות והחסרונות שלה.

עד כה, טכניקות רצף לאפשר להשיג את רצף של הגנומים המלאים, מן prokaryotes קטן שמרים לגנום האנושי.

אינדקס

• 1 מבנה הדנ"א
• 2 היסטוריה
• 3 שיטת סנגר
  • 3.1 מרכיבים עיקריים של התגובה
  • 3.2 קריאת התוצאות
• 4 רצף אוטומטי
• 5 מקס 'גילברט רצף
  • 5.1 נוהל
  • 5.2 קריאת התוצאות
• 6 רצף מסיבי
  • 6.1
  • 6.2 רצף על ידי סינתזה
  • 6.3 רצף על ידי קשירת
  • 6.4 רצף Ion Torrent
• 7 דוגמאות
  • 7.1 רצף הגנום האנושי
• 8 חשיבות ויישומים
• 9 הפניות

מבנה הדנ"א

כדי להבין את שיטות וטכניקות המשמשים רצף דנ"א, יש צורך לדעת היבטים מרכזיים מסוימים של המבנה והרכב של המולקולה.

דנ"א הוא ביומולקולה שנמצאת בכל היצורים החיים, מחיידקים ועד חיות ימיות גדולות. לאורגנים - כמו המיטוכונדריה והכלורופלסטים - יש מולקולת דנ"א עגולה בתוכם. אפילו בכמה וירוסים, החומר הגנטי שנמצא הוא DNA.

מבחינה מבנית, DNA הוא סט של נוקליאוטידים. כל אחד מהם משולב על ידי פחמימות, בסיס חנקני (A, T, C או G) וקבוצת פוספט. המטרה של רצף DNA היא לחשוף את הסדר שבו ארבעה בסיסים ניטרוגניים נמצאים ברצף.

היסטוריה

באמצע שנות ה -50, החוקרים ווטסון וקריק תיארו את מבנה ה- DNA באמצעות טכניקות כריסטולוגיות. עם זאת, אף אחד מהחוקרים הללו לא הצליח למצוא דרך לחשוף את הרצף.

אמנם היו כמה קודמיו, האירוע החשוב ביותר היה יצירת שיטת סנגר, בשנת 1977. פרדריק סנגר, אבי השיטה היה ביוכימאי בריטי, זוכה שני פרסי נובל על תרומתו העצומה שלהם במדעים הביולוגיים.

טכניקה זו ידועה גם בספרות כמו "סיום שרשרת" או דיידוקסינוקליוטידים. בהמשך נתאר את העקרונות של טכניקה זו ואת אלו שפותחו על בסיס השיפור והחדשנות של זה.

השיטה של ​​סנגר

התפתחות שיטתו של סנגר היתה אירוע מכריע בביולוגיה מולקולרית. זה כולל את המרכיבים הבסיסיים של תהליך שכפול דנ"א המתרחש בדרך כלל בתא, אבל על ידי הוספת מרכיב מיוחד: dideoxynototides.

המרכיבים העיקריים של התגובה

- פולימראז DNA: פולימראז DNA האנזים הוא מרכיב חיוני של התהליך. מולקולה זו עוסקת שכפול של גדיל DNA ותפקידה הוא סינתזה של הרשת החדשה, התאמת עם triphosphates deoxyribonucleotide משלימה.

נזכיר כי תימין DNA (T) להזדווג עם adenines (א) באמצעות שני קשרי מימן, ואילו ציטוזין (C) עושה עם גואנין (G) על ידי שלושה גשרים.

- נוקלאוטידים סנגר רצף כוללת שני סוגים של נוקלאוטידים, 2'-deoxynucleotides ארבע (מקוצר כמו dATP, dGTP, dTTP ו dCTP) וארבעת dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP, ddCTP ו ddTTP) מיוחד.

למרות dideoxynototides דומים מונומרים כי הם משולבים בדרך כלל לתוך ה- DNA, הם חסרים -OH קבוצה במבנה שלהם. זה עושה את זה בלתי אפשרי להוסיף נוקליאוטיד חדש לרשת.

לכן, כאשר נוקליאוטידים מיוחדים מתווספים - בצורה אקראית לחלוטין - לשרשרת במבנה, הסינתזה משותקת. בדרך זו, בסוף התגובה, יש שרשראות בגדלים שונים, כל אחת שבה התגובה נעצרה בנקודה אחרת.

בניסויים, ארבעה ניסויים מוכנים. כל אחד מהם מכיל את ה- DNA המופק מהמדגם הביולוגי של הריבית, הנוקליאוטידים הרגילים ואחד מארבעת סוגי הנוקליאוטידים המיוחדים. או נוקליאוטידים מיוחדים מסומנים עם סוג כלשהו של סמן ניאון (ראה להלן רצף אוטומטי).

קריאה של התוצאות

הצעד הראשון הוא להפריד כל אחד מן הרשתות מסונתז על פי גודלם. חלק יהיה ארוך יותר מאחרים, תלוי איפה בסיסים מיוחדים שולבו.

ישנן טכניקות ביוכימיות שונות המאפשרות הפרדת מרכיבי תערובת תוך שימוש בגודל כמאפיין מפלה. בשיטת סנגר, הרשתות השונות מופרדות באמצעות אלקטרופורזה. בגרסאות המתוחכמות ביותר של הטכניקה, אלקטרופורזה נימית משמש.

לפיכך, הגדילים הארוכים נעים פחות מהגרסאות הקצרות יותר. לאחר מכן, מערכת זו עובר הקורא שמזהה את הסמן כלול dideoxynototide כל. בדרך זו, סדר הסדר יכול להיות ידוע.

זה "הדור הראשון" הטכניקה היא מסוגלת לקרוא שברי DNA לא יותר מ 1 קילובאז. כיום, השיטה של ​​סנגר משמשת בכמה מעבדות, בדרך כלל בגרסאות המודרניות שלה. בנוסף, הוא משמש כדי לאמת את התוצאות שהושגו עם טכניקות מורכבות ביותר - אבל פחות מדויק.

רצף אוטומטי

כאשר נדרשת סידור בקנה מידה גדול, התהליך מואץ על ידי אוטומציה. זוהי וריאציה של שיטת סיום שרשרת של סאנגר, שם הפריימרים מסומנים במוצרי ניאון על מנת להבדיל ביניהם.

לאחר מכן, המוצר של התגובה מופעל אלקטרופורזה - כל בנתיב אחד. כאשר כל קטע משאיר את החלק האחרון של הג'ל, הוא מזוהה במהירות על ידי תווית ניאון שלה, עם שגיאה המקיפה 1%.

המערכות המתוחכמות ביותר יש מערכת של עד 96 צינורות נימי המופעל על ידי מחשב יחד עם רובוט. כלומר, 96 דגימות DNA ניתן להעריך בו זמנית. לפיכך, התהליך של אלקטרופורזה וניתוח התוצאות הוא אוטומטי לחלוטין.

ביום אחד, מערכות אלה יכולים רצף עד 550,000 בסיסים. במהלך התהליך, העבודה האנושית היא מיותרת, זה לוקח רק כ 15 דקות כדי להתחיל את השיטה.

סידור של מקס-גילברט

במקביל פרסם סנגר את עבודתו, שני חוקרים בשם אלן מקסאן ווולטר גילברט הצליחו לפתח שיטה נוספת להשגת רצף הדנ"א. השיטה זכתה לפופולריות באותה עת, אך לאחר מכן נעקבה משיפור שיטתו של סנגר.

בניגוד לשיטתו של סנגר, רצף של מקסאן וגילברט (או סידור כימי, כפי שהוא ידוע גם) אינו כרוך בתגובות הכלאה. המתודולוגיה כוללת סימון עם סוכנים תגובתיים בקצה אחד, ולאחר מכן תהליך טיהור.

אחד ההיבטים השליליים של טכניקה זו טמון המורכבות העצומה שלה בשימוש בכימיקלים מסוכנים עבור המשתמש. תקלות כימיות נגרמות על ידי יישום של DMS, חומצה פורמית, הידרזין והידראזין עם מלחים.

נוהל

הפרוטוקול מתחיל עם תיוג בקצה 5 'של גדיל עם סמן זרחן 32, ולאחר מכן שינוי כימי של הבסיס החנקני מתרחשת והוא מופרד. לבסוף מתרחש פיצול של האזור abasic.

ראשית שרשרת להיות רצף מקוצר לתוך קטעים קטנים יותר. שלב זה מבוצע עם אנזימים הגבלה, אשר התוצאה קיצוניים מצטיינים.

לאחר מכן, התגובה מתבצעת עם phosphatase אלקליין, שמטרתו לחסל את הקבוצה פוספט. לכן, kinase polynucleotide ניתן להשתמש כדי לבצע את תיוג.

השרשרת מאופיינת (שני הגדילים פתוחים). אז אנחנו ממשיכים ליישם את הכימיקלים. תגובות אלה מחשוף נעשים באופן מבוקר ואיזה סוגים של אג"ח נשברות על ידי כל כימיקל מיושם.

קריאה של התוצאות

כמו בשיטת סנגר, קריאת התוצאות כרוכה בהפרדה לפי גודל השרשראות המתקבלות במערכת אלקטרופורזה. המערכות המורכבות polyacrylamide לאפשר לקבל החלטה מספקת מאוד לקריאת הג'ל.

רצף מסיבי

רצף מסיבי מקיף סדרה של שיטות חדשות, מקוצר כמו NGS, מאנגלית "הדור הבא רצף ".

השיטות המקובלות כ- NGS דורשות צעד קודם של הגברה של דנ"א (הן אינן עובדות מול מולקולה אחת). בנוסף, פלטפורמות בשימוש להשתנות באופן נרחב. העקרונות של השיטות הנפוצות ביותר יתוארו להלן:

Pyrosequencing

זה כרוך ניטור השחרור של pyrophosphate, אשר מתרחשת בכל פעם נוקלאוטיד חדש מתווסף גדיל ה- DNA. מערכת אנזים הוא מצמידים, כך פליטת אור (אשר לגילוי על ידי מצלמה) מתרחשת בכל פעם נוקלאוטיד חדש משולב.

התהליך מתחיל עם הדגירה הנפרדת של כל בסיס חנקני כדי לבדוק אם יש פליטה אור. Pyrosequencing יכול לבצע את הקריאה של גדילים ארוכים, אבל שיעור השגיאה נמצא גבוה.

סידור על ידי סינתזה

זה כולל שילוב של נוקליאוטידים שכותרתו. מרכיבים אלה פלואורסצנטי מתווספים, שטף, ואת נוקלאוטיד המאוגדת הוא ציין. לאחר מכן, תיוג נוקליאוטידים מסולק, ואת סינתזה של גדיל יכול להמשיך. בשלב הבא, נוקלאוטיד שכותרתו ישולבו גם כן, והצעדים שצוינו יחזרו על עצמם.

חסרון אחד עם טכניקה זו מתרחשת כאשר סמנים ניאון לא בוטלו לחלוטין. פליטות אלה ליצור שגיאות רקע, וכתוצאה מכך שגיאות משמעותיות.

סידור על ידי קשירת

טכניקה זו משתנה מאחרים, שכן הוא אינו משתמש ב- DNA polymerase. במקום זאת, האנזים מפתח עבור מתודולוגיה זו היא ligase. הנה שברי דנ"א בשימוש שכותרתו fluorescently, מחויב על ידי האנזים מזוהה.

הבעיה הגדולה ביותר עם טכניקה זו היא אורך קצר מאוד של קטע המסוגל עיבוד.

יון רצף מבול

טכניקה זו מבוססת על המדידה של יון⁺ אשר משוחרר בכל פעם נוקלאוטיד חדש משולב. העיקרון הוא די דומה pyrosequencing, אבל הרבה יותר זול.

דוגמאות

רצף הגנום האנושי

רצף הגנום של בני האדם היה אחד האתגרים המבטיחים ביותר בביולוגיה, כמו גם להיות אחד היריבות ביותר לשבחים בהיסטוריה של המדע. למעשה, עבור המדענים המעורבים בפרויקט, רצף הגנום הפך לתחרות.

בשנת 1990 הוא התחיל מה שנקרא "פרויקט הגנום האנושי", בראשות המדען המפורסם, זוכה פרס נובל, ג'יימס ווטסון. לאחר שנה אחת, בשנת 1991, ונטר לוקח את האתגר של "מכה" ווטסון ו רצף הגנום לפניו. עם זאת, בשנת 1992, ווטסון בדימוס והפיקוד נלקח על ידי חוקר אחר.

ב -1995 הודיע ​​ונטר על הצלחתו ברצף המלא של גנום חיידקי בשיטת ריצוף אקראית. כמו כן, צוות מנוגד הודיעה שנה לאחר מכן רצף של הגנום שמרים.

בשנת 2000 הסתיים המירוץ. שתי החברות פירסמו את התוצאות הראשוניות של הגנום השלם בשני כתבי עת יוקרתיים ביותר במדע: הטבע ו מדע.

עם זאת, מדענים המשיכו לעבוד על שיפור ההצעות, ובשנת 2006 הושלמו רצפים מסוימים כרומוזומים אנושיים.

חשיבות ויישומים

לדעת את הסדר של נוקליאוטידים של מולקולה חשוב כמו דנ"א הוא בעל ערך עבור ביולוגים ואנשי מקצוע קשורים. שרשרת זו של polynucleotides מכיל את כל המידע הדרוש לפיתוח ותחזוקה של כל צורות החיים.

מסיבות אלה, הידע על רצף זה חיוני למחקר ביולוגי. ביסודו של דבר, רצף מאפשר לנו למדוד את אחד המאפיינים החשובים ביותר של מערכות ביולוגיות ולבסס הבדלים ביניהם.

רצף הוא בשימוש נרחב על ידי טקסונומיסטים ו systematists, שכן רצפי DNA מסוימים מאפשרים לקבוע קריטריונים כדי להסיק אם שני אורגניזמים שייכים לאותו מין או לא, כמו גם להיות מסוגל להציע השערות על היחסים הפילוגנטי ביניהם..

בנוסף, רצף דנ"א יש יישומים בתחום הרפואה ואבחון. לדוגמה, יש מערכות סבירות ונגישות אשר, באמצעות רצף, מאפשרים לנו להעריך את הנטייה לפתח מחלות מסוימות (כגון סרטן) באמצעות מה שמכונה פשוט פולימורפיזמים נוקלאוטידים (SNP)..

חקירות של סוג פלילי ו פלילי יש גם מועשר עם טכניקות של רצף, והוא יכול לשמש ראיה אמינה השתתפות של אדם מסוים בפשע.

הפניות

1. הת 'ר, ג' יי מ ', & שרשרת, ב' (2016). רצף של sequencers: ההיסטוריה של רצף DNA. גנומיקה, 107(1), 1-8.
2. קובלט, ד.ק., שטיינברג, ק.מ., לארסון, ד'א', וילסון, ר'ק', ומרדיס, א.ר. (2013). הדור הבא של רצף המהפכה והשפעתה על הגנומיקה. תא, 155(1), 27-38.
3. לוי, י. (2010). יריבויות מדעיות. מגלילאו לפרויקט הגנום האנושי. פרנינפו.
4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A. R. (1977). רצף DNA עם מעכבי הפסקת שרשרת. דברי האקדמיה הלאומית למדעים, 74(12), 5463-5467.
5. Schuster, S. C. (2007). רצף הדור הבא הופך את הביולוגיה של היום. שיטות טבע, 5(1), 16.
6. שו, ג'יי (עורך). (2014). הדור הבא רצף. העיתון האקדמי.