Proteinase K מאפיינים, פעילות אנזימטית ויישומים

ה קי הוא אנזים ששייך לקבוצה של פרוטאזות סרין, כלומר, יש במרכז קטליטי פעיל שלה סרין חומצת אמינו ויש לו את הפונקציה של שבירת קשרים פפטיד ידי הידרוליזה. בתורו אנזים זה שייך למשפחה של חלבונים subtilisins (פפטידאז S8).

Proteinase K יש משקל מולקולרי (MW) של 28,900 daltons ו היה מבודד בפעם הראשונה בשנת 1974 מ תמציות של הפטרייה אלבום אנגיודונטיום, הידוע בעבר בשם טריטיירצ'יום אלבום.

זה מציג יכולת proteolytic גבוהה, הוכיח להיות מסוגל להשפיל את נוכחות הקראטין בשיער. המילה קראטין באנגלית נכתב "קראטין", ומכאן נקרא "proteinase K".

בשל יכולת גבוהה לדבוק חלבונים מקומיים, אנזים זה שימושי בשיטות ביולוגיה מולקולרית שונים. הוא משמש בעיקר לבודד ולהכין חומצות גרעין עם משקל מולקולרי גבוה (MW).

Proteinase K פועל על ידי שחרור DNA גרעיני, תוך השמדת חלבונים ו inactivates RNases ו DNases, כלומר, מבטלת את נוקלאזות ההכנות DNA ו- RNA..

מאידך גיסא, זה כבר נראה כי proteinase K יכול hydrolyze כמה חלבונים ילידים מפוגל, אשר עורר את האינטרס של החוקרים לשימוש שלה במחקר של חלבונים פריון (PRPC).

עם זאת, למרות העצמה שלה גבוהה קיימים חלבוני מפרקי חלבונים עמידים הפעולה של proteinase ק ביניהם, כמה חלבונים חריגים הנקראים פריונים (PrPSc) קשורים TSEs הם.

אינדקס

• 1 מאפיינים של proteinase K
• פעילות אנזימטית
• 3 יישומים
• 4 יתרונות של חלבון K
• 5 חלבונים עמידים בפני חלבונים
• 6 הפניות

מאפייני חלבון K

ל- Proteinase K יש מבנה שלישוני שנוצר בשלוש שכבות, עם גיליון β של שבע שרשראות בין שתי שכבות של פרוסות. מכיוון שהוא שייך למשפחת פפטידס S8, הוא מאופיין בכך שיש לו משולש קטליטי באתר הפעיל שלו, אשר סדר רציף (Asp, שלו ו סר), אשר מבדיל אותם ממשפחות אחרות של פפטידים..

אנזים זה מקבוצה של פרוטאזות serine מאופיין hydrolyzing את האג"ח פפטיד קרוב לקבוצת carboxylic של חומצות אמינו aliphatic וארומטיות.

יתר על כן, הוא מסוגל לפעול בנוכחות מסוימת מאכל, כגון סודיום דודציל סולפט (SDS), Tris-HCl ו EDTA, אשר משמש כדי לעזור denaturation של חלבונים, מה שגרם להם לאבד חומרי מבנה מולדתם.

זהו צעד ראשוני בהכנת חלבונים עבור טכניקת אלקטרופורזה. טווח ה- pH שבו מעשים proteinase K הוא די רחב (2.0 עד 12.0), עם pH אופטימלי בין 7.5 ל 12.0, ואת נקודת isoelectric שלה הוא 8.9. כפי שניתן לראות, הוא פעיל נגד מגוון רחב מאוד של pH.

מאפיין נוסף בולט ב proteinase K היא יציבותה בנוכחות של טמפרטורות גבוהות (50 - 60 ° C).

פעילות אנזימטית

Proteinase K זקוק לנוכחות של סידן יון, אם כי זה לא משפיע על פעילותה, אם זה חיוני כדי לשמור על יציבותה.

עבור חלבון K לבצע את העיכול המלא של המצע, זמן מגע משוער של בין 5 דקות ל 2 שעות הוא הכרחי.

עם זאת, במובן זה Daza et al לעומת טוהר הדנ"א שהושג במספר פעמים של חשיפה ל- proteinase K, והסיק כי הדגירה הממושכת (עד 24 שעות) משפרת באופן משמעותי את איכות ה- DNA.

עכשיו, ביחס לריכוז המשמש האנזים proteinase K בפרוטוקולים שונים, ניתן לומר כי היא מגוונת מאוד.

זה יכול לשמש ריכוזים נמוכים מאוד (5 מיקרוגרם / מ"ל) לריכוזים של 500 מיקרוגרם / מ"ל. אבל ריכוז העבודה השכיח ביותר בטווח בין 50-100μg / מ"ל, במיוחד עבור עיכול חלבון ו inactivation nuclease. למרות ריכוז של 2 מ"ג / מ"ל ​​נדרש לטיפול רקמות.

יישומים

היישומים שלה הם רחבים מאוד וניתן לסכם את הדברים הבאים:

-הוא משמש לעיכול של חלבונים בשיטות מיצוי DNA כמו מספר: קצוב המלחה, PK-SDS, cetyltrimethylammonium ברומיד אמוניום ברומיד (CTAB), ו יצטט אשלגן שונה חילוץ עם יודיד נתרן.

-איטום של נוקלאזות (RNases ו DNases).

-בטכניקה הכלאה באתרם (HIS), כדי לעזור לשחרר את החומצה הגרעינית, בנוסף לחיסול חלבונים לא רצויים.

-שינוי חלבון.

-ברמת המחקר, במחקרים שונים.

היתרונות של proteinase K

כמה מחקרים השוואתיים בוצעו בין טכניקות מיצוי DNA באמצעות Proteinase K, עם אחרים שאינם משתמשים בו וכולם מסיקים כי יש יתרונות גדולים יותר בעת שימוש באנזים. בין היתרונות ניתן לציין את הדברים הבאים:

-גבוה DNA מולקולרית משקל באיכות גבוהה וטוהר מתקבל.

-ה- DNA שחולץ הוא יציב עד 3 חודשים.

דנ"א חילוץ ניתן להשתמש בטכניקות הבאות: כתם דרום, תגובת שרשרת פולימראז (PCR), אלקטרופורזה, בין היתר.

חלבונים עמידים ל- proteinase K

המחקרים הגיעו למסקנה כי פריונים (חלבונים חריגים רעיל PrPSc) הם נבדלים חלבוני PrPC (מקורי) כדי להיות עמיד בפני הפעולה של proteinase K, בעוד PrPC רגיש פעולה.

מחברים אחרים תיארו כי במבנה של PrPSc יש חלקים רגישים ואחרים עמידים proteinase K. עם זאת, שני החלקים הם רעילים באותה מידה זיהומיות..

מצד שני, Bastian ושיתופי פעולה בשנת 1987 מבודד 4 חלבונים של 28, 30, 66 ו 76 קדה מ מינים של ספירופלסמה מירום. כולם היו עמידים לפעולה של proteinase K וגם היה תגובה צולבת עם כמה prions.

זה ידוע כי מין זה יכול לגרום לקטרקט וניזק נוירולוגים משמעותי ובשל ממצאים מדעיים בסטיאן, בין מחקר אחר, ניסה לקשר מיקרואורגניזם זה עם כ"ספגות מוח מדבקים.

עם זאת, האטיולוגיה של פתולוגיה נוירולוגית ניוונית זו עדיין מיוחסת לפריונים כיום.

במובן זה, בטלר ומשתפי פעולה בשנת 1991 זיהה ואפיין קבוצה של 40 KDA חלבון עמיד חלבון K משני זנים של מיקופלאסמה היוריני. פתוגן זה משפיע על החזירים, מדביק רקמות שלהם, אבל במקרה זה לא היה שום תגובה צולבת עם prions נבדק.

יש צורך במחקרים נוספים כדי להבהיר אלמונים רבים על כך.

הפניות

1. Bastian F, ג 'נינגס R, ו Gardner W. 1987 Antisum כדי scrapie הקשורים חלבון fibril חוצה מגיב עם ספירופלסמה מירומ חלבונים סיבי. ג. מיקרוביול. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, המלך J, Ruiz V. הערכה של מיצוי דנ"א שיטת טיהור מ רקמת שריר קבוע פורמלין מ גופות לא מזוהים.  מגזין מד, 2014; 22 (1): 42-49,
3. G באטלר, קוטאני H, קונג L, M פריק, Evancho S, Stanbridge E, וזה McGarrity G. זיהוי ואפיון חלבונים עמידים K proteinase ב חברים בכיתה Mollicutes. זיהום וחסינות, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, מרוביאו א, הררה L, et al. השוואה בין שני פרוטוקולים לחילוץ DNA מ טריפנוסומה קרוזי גדל במדיום axenic. L מפעל Med בריאות הציבור  2014; 31 (2): 222-227. זמין ב: scielo.org
5. Jimmnez G, Villalobos M, Jiménez E ו- Palma W. קביעת האפקטיביות של חמישה פרוטוקולי דנ"א מיצוי מחומר פרפין למחקרים מולקולריים. Rev Méd Univ קוסטה ריקה. 2007; 1 (1): 10-19.