אנזימים הגבלת פונקציות, מנגנון פעולה, סוגים ודוגמאות

ה אנזימי הגבלה הם endonucleases המשמשים ארכאה וחיידקים מסוימים כדי לעכב או "להגביל" את התפשטות הנגיפים בתוכם. הם שכיחים במיוחד בחיידקים והם חלק ממערכת ההגנה שלהם נגד דנ"א זר המכונה מערכת הגבלה / שינוי.

אנזימים אלה מזרזים את חיתוך הדנ"א הדו-גדילי באתרים מסוימים, תוך שחזור ובלי שימוש באנרגיה נוספת. רוב דורשים נוכחות של cofactors כגון מגנזיום או קטיונים divalent אחרים, אם כי חלקם דורשים גם ATP או S-adenosyl methionine.

אנדונואלאס הגבלה התגלו בשנת 1978 על ידי דניאל Nathans, ארבר Werner ואת המילטון סמית, שקיבל את פרס נובל לרפואה על גילוי שלהם. שמו בדרך כלל נובע מן האורגניזם שבו הם נצפו בפעם הראשונה.

אנזימים כאלה נמצאים בשימוש נרחב בפיתוח שיטות שיבוט DNA ו ביולוגיה מולקולרית אחרים אסטרטגיות הנדסה גנטית. מאפייניו של ההכרה ברצפים ספציפיים ויכולת לחתוך רצפים הקרובים לאתרי ההכרה הופכים אותם לכלי רב עוצמה בניסויים גנטיים.

השברים שנוצרו על ידי אנזימי ההגבלה שפעלו על מולקולת דנ"א מסוימת יכולים לשמש ליצירת מחדש של "מפה" של המולקולה המקורית באמצעות מידע על האתרים שבהם האנזים חותך את ה- DNA.

אנזימי הגבלה מסוימים עשויים להיות בעלי אותו אתר הכרה בדנ"א, אבל הם לא בהכרח חותכים אותו באותו אופן. לכן, ישנם אנזימים שהופכים חתכים משאירים הקצוות קהה ואנזימים כי לחתוך לעזוב את הקצוות מלוכדות, אשר יש יישומים שונים בביולוגיה מולקולרית.

כיום ישנם מאות אנזימים שונים להגבלת מסחר זמינים, המוצעים על ידי בתים מסחריים שונים; אנזימים אלה פועלים כמו מספריים "מותאמים אישית" מולקולריים למטרות שונות.

אינדקס

• 1 פונקציות
• מנגנון פעולה
• 3 סוגים
  • 3.1 סוג אני אנזימים הגבלה
  • 3.2 סוג אנזימי הגבלת II
  • 3.3 אנזימי הגבלת III
  • 3.4 סוג אנזימי הגבלת IV
  • 3.5 אנזימי הגבלת V
• 4 דוגמאות
• 5 הפניות

פונקציות

אנזימי הגבלה לשרת את הפונקציה הפוכה של פולימריות, שכן הם hydrolyze או לשבור את הקשר אסתר בתוך הקשר phosphodiester בין נוקליאוטידים הסמוכים בשרשרת נוקליאוטידים.

ביולוגיה מולקולרית והנדסה גנטית הם בשימוש נרחב כלים לבניית ביטוי שיבוט וקטורים, כמו גם לצורך זיהוי רצפים ספציפיים. הם גם שימושיים לבניית גנומים רקומביננטיים ויש להם פוטנציאל ביוטכנולוגי גדול.

ההתקדמות האחרונה בטיפול גנטי עושה שימוש שוטף באנזימי הגבלה להכנסת גנים מסוימים לקטורים שהם כלי תחבורה של תאים כאלה לתאים חיים, וכנראה שיש להם את היכולת להכניס לגנום התא כדי לבצע - שינויים קבועים.

מנגנון פעולה

אנזימי הגבלה יכולים לזרז את חיתוך הדנ"א הדו-גדילי, למרות שחלקם מסוגלים לזהות רצפי דנ"א חד-גדיליים ואפילו רנ"א. החתך מתרחש לאחר ההכרה ברצפים.

מנגנון הפעולה מורכב בהידרוליזה של קשר הפוספודיסטר בין קבוצת פוספט לבין דיוקסיריבוז בעמוד השדרה של כל גדיל של דנ"א. רבים מן האנזימים מסוגלים לחתוך באותו מקום שהם מכירים, בעוד שאחרים חותכים בין 5 ל 9 זוגות בסיסים לפני או אחרי זה..

בדרך כלל אלה אנזימים לחתוך בקצה 5 'של קבוצת פוספט, מה שהופך שברי דנ"א עם סוף 5' phosphoryl ו מסוף 3 'בסוף hydroxyl.

מאחר והחלבונים אינם באים במגע ישיר עם אתר ההכרה בדנ"א, יש לתרגם אותם באופן רצוף עד שהם מגיעים לאתר הספציפי, אולי באמצעות מנגנונים "מחליקים" על חוט ה- DNA..

במהלך חתך אנזימטי, הצמדת phosphodiester של כל אחד מחוטי הדנ"א ממוקם באחד האתרים הפעילים של אנזימי הגבלה. כאשר האנזים עוזב את אתר ההכרה והחיתוך, הוא עושה זאת באמצעות אסוציאציות חולפות לא ספציפיות.

סוגים

נכון לעכשיו, חמישה סוגים של אנזימים הגבלה ידועים. להלן תיאור קצר של כל אחד מהם:

סוג אני אנזימים הגבלה

אנזימים אלה הם חלבונים פנטמריים גדולים עם שלוש יחידות משנה, הגבלה, מתילציה ועוד להכרה ברצפים בדנ"א. אלה endonucleases הם חלבונים רב תכליתיים מסוגל להגביל הגבלת ותגובות שינוי, יש להם פעילות ATPase וגם טופואיזומראז DNA.

אנזימים מסוג זה היו האנדוקלאסים הראשונים שהתגלו, הם טוהרו בפעם הראשונה בשנות ה -60 ומאז הם נחקרו בעומק רב.

סוג אני אנזימים אינם בשימוש נרחב ככלי ביוטכנולוגי, שכן אתר חיתוך יכול להיות במרחק משתנה של עד 1,000 זוגות בסיס מאתר ההכרה, מה שהופך אותם אמינים במונחים של שחזור ניסיוני.

סוג II אנזימים הגבלה

הם אנזימים המורכבים של homodimers או tetramers לחתוך DNA באתרים מוגדרים בין 4 ל 8 bp אורך. אלה אתרי חיתוך הם בדרך כלל palindromic, כלומר, הם מזהים sequences כי הם לקרוא באותו אופן בשני הכיוונים.

רבים מן סוג II אנזימים הגבלת חיידקים לחתוך דנ"א כאשר הם מזהים את אופיו הזר, שכן אין להם את השינויים האופייניים כי ה- DNA עצמו צריך..

אלה הם אנזימים הגבלה הפשוטה ביותר שכן הם אינם דורשים כל cofactor אחר מאשר מגנזיום (MG +) כדי לזהות לחתוך את רצפי DNA.

הדיוק של אנזימים הגבלת סוג II בזיהוי וחיתוך של רצפים פשוטים ב- DNA במיקומים מדויקים הופך אותם לאחד הנפוצים ביותר והכרחיים ברוב ענפי הביולוגיה המולקולרית.

בתוך הקבוצה של סוג II אנזימים הגבלה הן subclasses מרובים מסווגים לפי מאפיינים מסוימים ייחודיים לכל אחד. הסיווג של אנזימים אלה נעשה על ידי הוספת אותיות של האלפבית, מ- A עד Z בעקבות שם האנזים.

חלק מתת-הקבוצות הידועות ביותר לתועלתן הן:

תת - קבוצה IIA

הם דימרים של יחידות משנה שונות. הם מכירים רצפים אסימטריים ומשמשים כמבשרי אידיאלי עבור הדור של אנזימים חיתוך.

תת-קבוצה IIB

הם מורכבים דימר אחד יותר לחתוך את הדנ"א משני צידי רצף הכרה. הם חתכו שתי גדילי דנ"א במגוון של זוגות בסיס מעבר לאתר ההכרה.

תת קטגוריה IIC

אנזימים מסוג זה הם פוליפפטידים עם פונקציות של חלוקה ושינוי של גדילי דנ"א. אנזימים אלה חתכו את שתי הגדילים באופן אסימטרי.

תת - קבוצה IIE

אנזימים של subclass זה משמשים ביותר בהנדסה גנטית. יש להם אתר קטליטי ובדרך כלל דורשים אפקט אלוסטרי. אנזימים אלה צריכים לקיים אינטראקציה עם שני עותקים של רצף ההכרה שלהם כדי לבצע חיתוך יעיל. בתוך subclass זה הם אנזימים EcoRII ו EcoRI.

סוג אנזימי הגבלת III

סוג III הגבלת endonucleases מורכבים רק שתי יחידות משנה, האחראי על זיהוי ה- DNA ושינוי, ואילו השני אחראי על חיתוך רצף.

אנזימים אלה דורשים שני cofactors לתפקוד שלהם: ATP ומגנזיום. אנזימי הגבלה מסוג זה מחזיקים בשני אתרי הכרה אסימטריים, מתרגמים את ה- DNA באופן תלוי ב- ATP וחותכים אותו בין 20 ל -30 bp בסמוך לאתר ההכרה..

סוג IV אנזימים הגבלה

סוג אנזימים IV קל לזהות מאז הם חותכים DNA עם תגי מתילציה, הם מורכבים של מספר יחידות משנה שונות אשר אחראים להכרה וחיתוך רצף ה- DNA. אנזימים אלה להשתמש cofactors GTP ו מגנזיום divalent.

אתרים ספציפיים לחיתוך כוללים שרשראות נוקליאוטידים עם שאריות של ציטוזין methylated או hydroxymethylated בגדילים אחת או שתיהן של חומצות גרעין.

סוג אנזימי הגבלה V

סיווג זה מקבץ את האנזימים מסוג CRISPER-Cas, המזהים ומציעים רצפי DNA ספציפיים מאורגניזמים פולשים. אנזימים קאז להשתמש גדיל של CRISPER מסונתז המנחה RNA לזהות ולתקוף אורגניזמים פולשים.

אנזימים המסווגים כסוג V הם פוליפפטידים המובנים על ידי אנזימים מסוג I, II ו- II. הם יכולים לחתוך קטעים של ה- DNA של כמעט כל אורגניזם עם מגוון רחב של אורך. גמישותם וקלות השימוש שלהם הופכים את האנזימים לאחד הכלים הנפוצים ביותר בהנדסה גנטית כיום עם אנזימים מטיפוס II.

דוגמאות

אנזימי הגבלה שימשו לאיתור פולימורפיזם DNA, במיוחד במחקרים על גנטיקה של אוכלוסייה ומחקרים אבולוציוניים באמצעות דנ"א מיטוכונדריאלי, על מנת לקבל מידע על שיעורי תחליפי נוקליאוטידים..

נכון לעכשיו, וקטורים המשמשים להפיכת חיידקים למטרות שונות יש אתרים multiclonache שבו אתרי הכרה עבור אנזימים הגבלה מרובים נמצאים..

בין אנזימים אלה, הנפוצים ביותר הם EcoRI, II, III, IV ו- V, שהושג ותיאר בפעם הראשונה E. coli; הינדי, מתוך H. השפעת ו BamHI של ב amyloliquefaciens.

הפניות

1. Bickle, T. A., & Kruger, D. H. (1993). ביולוגיה של הגבלת ד.נ.א.. ביקורות מיקרוביולוגיות, 57(2), 434-450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D. A., & Horvath, P. (2007). CRISPR מספק נרכש התנגדות נגד וירוסים prokaryotes. מדע, 315(מרץ), 1709-1713.
3. (D), 2002 (. הפרספקטיבה המולקולרית: הגבלת אנדו-. תאי גזע יסודות הרפואה לסרטן, 20, 190-191.
4. Halford, S. E. (2001). מקפץ, קופץ ו looping על ידי אנזימים הגבלה. חברה ביוכימית עסקאות, 29, 363-373.
5. Jeltsch, A. (2003). שמירה על זהות המינים ושליטה על חיידקים של חיידקים: פונקציה חדשה למערכות הגבלה / שינוי? ג 'ין, 317, 13-16.
6. קרבס, י ', גולדשטיין, א', קילפטריק, ס '(2018). גנים של לוין XII (12 עורכים). ברלינגטון, מסצ 'וסטס: ג' ונס & Bartlett למידה.
7. Li, Y, Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... סוג רתימה מסוג I ו- CRISPR-CAS עבור עריכת הגנום. חומצות גרעין מחקר, 1-12.
8. Lenen, W. A.M., Dryden, D.T.F, Raleigh, E.A, & Wilson, G.G (2013). סוג אני אנזימים הגבלה וקרוביהם. חומצות גרעין מחקר, / 25.
9.  Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). הגבלת האנדוקלזות בניתוח ומבנה מחדש של מולקולות דנ"א. אנו. הכומר ביוכם., 273-293.
10.  Nei, M., & Tajima, F. (1981). דנ"א פולימורפיזם לגילוי על ידי הגבלת endonucleases. גנטיקה, 145-163.
11.  פינגוד, א., פוקסרייטר, מ., פינגאוד, ו., וונדה, וו. (2005). מדעי החיים הסלולריים והמולקולריים סוג endonucleases הגבלת II: מבנה ומנגנון. מדעי החיים המולקולריים והמולקולריים, 62, 685-707.
12.  רוברטס, ר '(2005). כיצד אנזימי הגבלה הפכו לסוסי העבודה של הביולוגיה המולקולרית. PNAS, 102(17), 5905-5908.
13.  Roberts, R. J., & Murray, K. (1976). הגבלת endonucleases. ביקורות קריטיות בביוכימיה, (נובמבר), 123-164.
14.  Stoddard, B. L. (2005). מבנה endonuclease Homing ותפקוד. ביקורות רבעוניות של ביופיסיקה, 1-47.
15.  Tock, M. R., & Dryden, D. T. F. (2005). ביולוגיה של הגבלה ואנטי-הגבלה. הדעה הנוכחית במיקרוביולוגיה, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib/2005.06.003
16.  Wilson, G. G., & Murray, N. E. (1991). מערכות הגבלה ושינוי. אנו. הכומר ז'נה., 25, 585-627.
17.  Wu, Z., & Mou, K. (2016). תובנות גנומיות לתוך Campylobacter jejuni ארסיות וגנטיקה האוכלוסייה. להדביק דיס. תרגם. Med., 2(3), 109-119.
18.  יואן, ר '(1981). מבנה ומנגנון של Endonucleases הגבלת רב תפקודי. אנו. הכומר ביוכם., 50, 285-315.